Т 4- IФА

Інструкція

по використанню тест-системи імуноферментної

для визначення загального тироксина в сироватцi та плазмi кровi

(Т 4- IФА)

Державний реєстраційний номер № 1247/2002

Тiльки для дiагностики in vitrо.

Набір вироблений по технології та з компонентів фірми Хема - Медіка , Москва

Введення

Тироксин (3,5,3’,5’-тетрайодотиронін, Т4) – основний гормон щитовидної залози з молекулярною масою 776,9 Да. Біосинтез Т4 цілком протікає в клітинах щитовидної залози. Йод, що попадає в організм,  всмоктується через стінки  кишечнику і надходить у фолікулярні клітини щитовидної залози, де негайно окислюється пероксидазою щитовидної залози і  зв'язується з тирозиновими залишками тиреоглобуліна, після чого в ході численних перетворень бере участь в утворенні гормонів шитовидної залози. Після секреції Т4 у сироватці зв'язується тиреоїд-єднальним глобуліном (75%), тиреоїд-єднальним преальбуміном (15%) та альбуміном (10%). У нормі не зв'язується із сироватковими білками тільки 0,02-0,04% тироксину. Вважають, що біологічні ефекти Т4 у першу чергу зв'язані з його вільною фракцією.

Показання для визначення Т4: дiагностика порушень функцій  щитовидної залози, особливо в населення екологічно несприятливих районів; гіпертиреоз; порушення єднальної ємності білків сироватки кровi (рівень Т4 підвищений); гіпотиреоз (рівень Т4 знижений); контроль проведеної терапії.

Принцип визначення

У наданiй тест-системi використовується принцип двосайтового (сендвiч) iмуноферментного аналiзу. У лунки мiкропланшета, на поверхнi якого адсорбованi специфiчнi анти-Т4-антитiла, вносять дослiджуваний зразок. Антиген iз зразка зв'язується з антитiлами на поверхнi лунки. У лунку вносять другi антитiла проти  iншого епiтопу Т4,  мiченi пероксидазою. Активність ферменту, зв'язаного на поверхнi лунки мiкропланшету, проявляється i вимiрюється додаванням хромоген-субстратної сумiшi, стоп-розчину та фотометрiєю при 450 нм. Iнтенсивнiсть кольорової реакцiї прямо пропорцiйна кiлькостi специфiчних антитiл у зразку.

Склад набору:

            1. Анти-Т4 IФА стрипи, 8х12 лунок ( 1 шт.)

2. Стрічка для закліювання стрипів(2 шт.)

3. Набiр калiбраторiв та контролiв, по 0.5 мл (всього 5 калiбраторiв: 0, 32, 64, 160, 320 нмоль/л; та 1 контрольний зразок)

4. Концентрат вiдмиваючого розчина, 22 мл (1 фл.)

5. Кон'югат, 5.2 мл ( 1 фл)

6. Субстрат, 11 мл (1фл.)

7. Стоп-розчин, 11 мл ( 1 фл)

Важливі зауваження по збереженню реагентів і виконанню тесту.

1. Не змішуйте і не використовуйте в одній постановці реагенти різних серій.

2. Після використання реагенту негайно закривайте кришку  флакона чи пробірки. Увага: закривайте кожен флакон своєю кришкою.

3. Усі компоненти набору повинні зберігатися в холодильнику (+2...+8^оС). Не заморожуйте набір.

4. Після розкриття пакета ретельно заклейте  лунки, що залишилися, стрічкою для закліювання, яка входить до складу набору, щоб запобігти впливу вологи пiд час зберiгання.

5. Увага! Під час всіх інкубацій необхідно заклеювати планшет клейкою стрічкою. Не допускайте пересихання лунок мікропланшета між стадіями постановки.

6. Усі проби і стандарти бажано ставити в двох паралелях (повторах).

7. Досліджувані сироватки повинні бути ретельно отцентрифуговані. Не використовуйте мутні, хильозні та гемолітичні зразки.

8. Якщо аналіз виробляється не в день узяття крові, сироватку варто зберігати при -20⁰С. Повторне заморожування-відтавання не допускається.

9.Відмивання мікропланшета може проводитися як вручну, так і з використанням автоматичних пристроїв. Вносите не менш 200 мкл відмивочного буфера у лунки при кожному відмиванні. Затримка при відмиванні («замочування») не потрібна. Після закінчення ручного відмивання різко перегорнiть мікропланшет на фільтрувальний папір для видалення залишків буфера.

10. Вимірюйте оптичну щільність протягом не більш 15 хвилин після зупинки реакції із субстратом.

Підготовка реагентів

1. Усі реагенти (включаючи необхідне число стрипів) перед використанням повинні бути доведені до кімнатної температури (20-25°З).

2. Приготуйте відмиваючий розчин: для цього концентрат  розбавте 10-кратним об’ємом дистильованої води в чистому посуді.

Проведення аналiзу

1.Помістiть у рамку потрібну кількість стрипів - зразки в 2 повторах та 12 лунок для калiбраторiв та контрольних зразкiв.

2.Внесiть у лунки по 50 мкл калiбратора або дослiджуваного зразка.

3.Внесiть у лунки по 50 мкл розчина кон'югату.

4.Iнкубуйте 30 хвилин при температурi 20-25° C.

5.Вiдмийте стрипи 5 разiв вiдмиваючим розчином.

6.Внесiть у лунки 100 мкл субстратного розчину.

7.Iнкубуйте 15 хвилин при температурi 20-25° C.

8.Внесiть у лунки 100 мкл стоп-розчину.

9.Визначте оптичну щільність у лунках на фотометрі при довжині хвилі 450 нм. Бланк фотометра виставляйте проти повітря.

Очикувані коливання контрольного зразка : 100 – 180 нмоль/л