Антитіла до ДНК – ІФА

Інструкція

по використанню тест-системи імуноферментної

для визначення антитіл до ДНК

 (нативної, денатурованої, формалінізованої)

в сироватці крові людини

(“Антитіла до ДНК – ІФА” )

Державний реєстраційний номер № 1247/2002

            Виявлення антитіл до ДНК може служити характеристикою процесів аутоімунітету.

Так, антитіла до нативної (двоспіральної) ДНК високоспецифічні для вовчаку червоного. При активному ревматичному процесі також відзначається значне підвищення антитіл до нативної ДНК. В ряді випадків ці антитіла можно виявити при вираженій активності хронічного активного гепатиту чи хворобі  Шегрена, аутоімунному увеїті.

Антитіла до термоденатурованої ДНК відображають активність ревматичних захворювань, а також зустрічаються при інших соматичних та інфекційних захворюваннях. Велика частота виявлення цих антитіл спостерігається при червоному вовчаку та склеродермії, особливо при її активних та злоякісних формах, хворобі Рейно та ін.

Антитіла до односпіральної формалінізованої ДНК широко зустрічаються як в нормі, так і при різноманітних інфекційних процесах (напр. туберкульозі), вірусних захворюваннях.

                                Принцип методу

Оснований на виявлені в сироватці крові антитіл, специфічних до антигену, адсорбованому на твердій фазі. Антитіла ,що приєдналися до твердої фази, виявляють за допомогою специфічного антиглобулінового кон’югату анти-Ig G (третій шар імунного комплексу). Активність ферменту в складі імунних комплексів визначають з допомогою субстрат – хромогенної суміші. Інтенсивність покрашення хромогену прямо пропорційна кількості антитіл в зразку.

                      Склад набору

1.      Планшет полістироловий з імобілізованим антигеном (1-4 стрип –нативна ДНК, 5-8 – денатурована ДНК, 9-12 – формалізована) (1 шт).

2.      Контрольні зразки  (1 упак.).

3.  Буфер фосфатно-сольовий (ФСБ) (1 флакон).

4.      Цитратно-фосфатний буфер (ЦФБ) (1 флакон).

5.      Розчин субстрату (1 флакон).

6.      Кон’югат, мічений пероксидазою (1 флакон).

7.      Зупиняючий розчин (1 флакон).

                       Досліджуваний матеріал

            Використовують свіжу, вільну від домішок сироватку. Зберігають зразки не більше 72 годин при +2+8⁰С. Довгострокове зберігання допускається в замороженому вигляді при температурі мінус 20⁰С. Повторні заморозка та розтавання не рекомендуються.

            Використання гемолізованих та ліпідемічних зразків не рекомендуються.

                           Підготовка реагентів 

            1. Перед постановкою дослідження набор витримують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.

2. Готують необхідну кількість розчину ФСБ, для чого розводять його в 10 раз дистильованою водою. При випаданні солі в осад в концентраті необхідно прогріти його при 30-40°С до повного розчинення осаду. Приготовлений розчин використовують для розведення сироваток та промивання планшетів.

3.      Підготовка робочого розчину кон¢югату: 10 мкл концентрованого розчину

кон¢югату розводять в 10 мл ФСБ. При постановці реакції тільки на частині планшету кількість кон¢югату  зменшуеться пропорційно. Робочий розчин кон¢югату готують безпосередньо перед використанням!

4. Підготовка субстратної суміші: до 9 мл дистильованої води добавляють 1мл концентрованого ЦФБ і 1 мл ТМБ-розчину. При постановці реакції тільки на частині планшету кількість субстратної суміші зменшується пропорційно. Робочий розчин субстратної суміші готують безпосередньо перед використанням!

                                                                      Проведення дослідження

1. В ямки необхідної кількості стрипів вносять по 90 мкл розчину ФСБ.

2. В ямки всіх стрипів з ФСБ вносять по 10 мкл контрольних зразків та досліджуваних сироваток в двох повторах.

3. Планшет інкубують протягом 40 хв при кімнатній температурі, періодично струшуючи або на шейкері.

4. Після інкубації планшет промивають 4-5 разів ФСБ, добавляючи в ямки по 200 мкл розчину.

5. В ямки промитого планшету вносять по 100 мкл робочого розчину кон’югату.

6. Планшет інкубують протягом 40 хв при кімнатній температурі, періодично струшуючи, або на шейкері.

 7. Планшет промивають 4-5 разів ФСБ.

8. В ямки промитого планшету вносять по 100 мкл субстратної суміші і інкубують в захищеному від світла місці 15-20 хвилин в залежності від ступеню розвитку окрасу. Зупиняють реакцію добавлянням в кожну ямку планшету по 100 мкл зупиняючого розчину.

9.Не більше як через 5-10 хвилин  міряють оптичну щільність в ямках планшету на аналізаторі імуноферментному при довжині хвилі 450 нм.

                         Оцінка результатів дослідження

            Міряють оптичну щільність (ОЩ) в усіх ямках. В ямках з контрольним негативним зразком  допускається ОЩ 0,1-0,2. Для визначення наявності антитіл використовують відношення ОЩ досліджуваної сироватки до ОЩ контрольного негативного зразку (ІР – індекс реакції):

ІР = ОЩ досліджуваної сироватки

                   ОЩ контрольного негативного зразку

ІР >1 свідчить про наявність антитіл. Враховуючи можливу похибку аналізу досліджувану сироватку вважають позитивною при ІР >1,5. При ІР£1,5 проба вважається негативною.     
                        
                                                                          Вимоги безпеки

1. Набор призначений тільки для діагностики in vitro. Категорично забороняється піпетування ротом.

2. Засобами індивідуального захисту при роботі з наборами є марлеві пов’язки  та гумові рукавички.

            3. Знезараження сироваток проводити згiдно з наказом МОЗ СРСР №408 вiд 29.12.89 р. «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране».

                               Умови транспортування та зберігання

1 Набори транспортують всіма видами закритого транспорту при температурі від +4 до +10⁰С. Допускається транспортування при температурі до +37⁰С не більше 72 годин.

2 Набори повинні зберігатися при температурі від +4 до +10⁰С. Не допускається замороження!

                                                                       Гарантії виробника

1 Виробник гарантує відповідність якості наборів вимогам цих ТУ при додержанні споживачем наведених у них умов транспортування та зберігання.

2 Гарантійний термін зберігання становить 6 місяців від дня виготовлення набору.  Після закінчення терміну зберігання набори підлягають переконтролю з метою перевірки їх працездатності.

3  Термін придатності стрипів після розкриття пакету становлює 1 місяць при температурі 2-8˚ С. Невикористані стрипи зберігають у щільно закритому пакеті !

                                                                                 Увага!

            1.  Перед постановкою дослідження набор витримати при кімнатній температурі протягом 30 хв.

            2. Перед роботою розкрити пакет, відрізавши запаяну смугу. Діставши необхідну кількість стрипів, щільно закрити за допомогою застібки (“зіпера”) для запобігання утворення конденсату та попадання вологи.