по використанню тест-системи імуноферментної  

для визначення  кортизола в сироватцi та плазмi кровi

( Кортизол - IФА)

                                                       Державний реєстраційний номер № 1247/2002                                                          

Тiльки для дослiджування in vitro

Введення

Кортизол – глюкокортикоїдний гормон, синтезований корою наднирникiв, з молекулярною  масою 362 Да. Менш 10% кортизола в циркулюючій крові знаходиться у фізіологічно вільній формі і виділяється із сечею в неметаболизованому виді. Секреція кортизолу  неоднакова в плині доби і підкоряється визначеному добовому ритму. Добова секреція кортизола складає 10-20 мг, досягаючи максимуму між 7-9 годинами ранку і 16-18 годинами. Кортизол є стресовим гормоном, що захищає організм від будь-яких різких змін фізіологічної рівноваги, впливаючи на метаболизм вуглеводів, білків і ліпідів, а також на електролітний баланс.

Показання до визначення кортизолу: oцінка функціонування системи гіпоталамус–гіпофіз-кора наднирників, особливо пiд час прийому стероїдних препаратiв; діагностика ендокринних захворювань (хвороба Аддисона і хвороба Iценко-Кушинга); діагностика деяких злоякісних захворювань.

Принцип визначення

У наданiй тест-системi використовується принцип конкурентного iмуноферментного аналiзу. У лунки мiкропланшета, на поверхнi якого адсорбованi специфiчнi анти-Кортизол-антитiла, вносять дослiджуваний зразок та кон'югат Кортизол-пероксидаза. Кортизол iз зразка конкурує з кон'югованим антигеном за зв'язок з антитiлами на поверхнi лунки. Активнiсть ферменту, зв'язаного на поверхнi лунки мiкропланшету, проявляється i вимiрюється додаванням хромоген-субстратної сумiшi, стоп-розчину та фотометрiєю при 450 нм. Iнтенсивнiсть кольорової реакцiї зворотньо пропорцiйна кiлькостi специфiчних антитiл у зразку.

Склад набору:

1. Анти-Кортизол IФА стрипи, 8х12 лунок  (1 шт.)

2. Стрічка для закліювання стрипів ( 2 шт.)

3. Набiр калiбраторiв та контролiв  по 0.5 мл (всього 6 калiбраторiв: 0, 50, 100, 400, 1000, 2000 нмоль/л; та 1 контрольний зразок)

4. Концентрат вiдмиваючого розчина, 22 мл ( 1 фл.)

5. Кон'югат, 11 мл ( 1 фл.)

6. Субстрат , 11 мл ( 1 фл.)

7. Стоп-розчин, 11 мл ( 1 фл.)

Важливі зауваження по збереженню  реагентів і виконанню тесту.

1. Не змішуйте і не використовуйте в одній постановці реагенти різних серій.

2. Після використання реагенту негайно закривайте кришку  флакона чи пробірки. Увага: закривайте кожен флакон своєю кришкою.

3. Усі компоненти набору повинні зберігатися в холодильнику (+2...+8^оС). Не заморожуйте набір.

4. Після розкриття пакета ретельно заклейте  лунки, що залишилися, стрічкою для закліювання,яка входить до складу набору, щоб запобігти впливу вологи пiд час зберiгання.

5. Увага! Під час всіх інкубацій необхідно заклеювати планшет клейкою стрічкою. Не допускайте пересихання лунок мікропланшета між стадіями постановки.

6. Усі проби і стандарти бажано ставити в двох паралелях (повторах).

7. Досліджувані сироватки повинні бути ретельно отцентрифуговані. Не використовуйте мутні, хильозні та гемолітичні зразки.

8. Якщо аналіз виробляється не в день узяття крові, сироватку варто зберігати при -20⁰С. Повторне заморожування-відтавання не допускається.

9.Відмивання мікропланшета може проводитися як вручну, так і з використанням автоматичних пристроїв. Вносите не менш 200 мкл відмивочного буфера у лунки при кожному відмиванні. Затримка при відмиванні («замочування») не потрібна. Після закінчення ручного відмивання різко перегорнiть мікропланшет на фільтрувальний папір для видалення залишків буфера.

10. Вимірюйте оптичну щільність протягом не більш 15 хвилин після зупинки реакції із субстратом

Підготовка реагентів

1. Усі реагенти (включаючи необхідне число стрипів) перед використанням повинні бути доведені до кімнатної температури (20-25°С).

2. Приготуйте відмиваючий розчин: для цього концентрат  розбавте 10-кратним об’ємом дистильованої води в чистому посуді. Отриманий розчин стабільний протягом 2-х діб при кімнатній температурі чи 10 діб у холодильнику (+2...+8^°С).

Проведення аналiзу

1. Помістiть у рамку потрібна кількість стрипів - зразки в 2 повторах та 14 лунок для калiбраторiв та контрольних зразкiв.

2. Внесiть у лунки по 20 мкл калiбратора або дослiджуваного зразка.

3. Внесiть у лунки по 100 мкл розчина кон'югату.

4. Iнкубуйте 60 хвилин при температурi 20-25°C.

5. Вiдмийте стрипи 5 разiв вiдмиваючим розчином.

6. Внесiть у лунки 100 мкл субстратного розчина.

7. Iнкубуйте 15 хвилин при температурi 20-25° C.

8. Внесiть у лунки 100 мкл стоп-розчину.

9. Визначте оптична щільність у лунках на фотометрі при довжині хвилі 450 нм.

Бланк фотометра виставляйте проти повітря

Приклад калібровочної кривої  ( вісь Х – конц.; вісь У – ОЩ  нмоль/л ) 

Очикувані коливання контрольного зразка :800 –1000 нмоль/л 

Нормальні величини

Грунтуючись на результатах досліджень, проведених лабораторiями , рекомендуємо користатися нормами, приведеними нижче. Разом з тим, відповідно до правил GLP (Гарної лабораторної практики), кожна лабораторія повинна сама визначити для себе параметри норми, характерні для обстежуваної популяції.

Донори : 140,0 – 600,0 нмоль/л.

Вимоги безпеки

 1  Набор призначений тільки для діагностики in vitro. Категорично забороняється піпетування ротом.

 2  Засобами індивідуального захисту при роботі з наборами є марлеві пов’язки  та гумові рукавички.

            3 Знезараження сироваток проводити згiдно з наказом МОЗ СРСР №408 вiд 29.12.89 р. «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране».

Умови транспортування

            1 Набори транспортують всіма видами закритого транспорту при температурі від +4 до +10⁰С. Допускається транспортування при температурі до +37⁰С не більше 72 годин.

2 Набори повинні зберігатися при температурі від +4 до +10⁰С. Не допускається замороження!

Гарантії виробника

            1 Виробник гарантує відповідність якості наборів вимогам цих ТУ при додержанні споживачем наведених у них умов транспортування та зберігання.

2 Гарантійний термін зберігання становить 6 місяців від дня виготовлення набору.  Після закінчення терміну зберігання набори підлягають переконтролю з метою перевірки їх працездатності

3  Термін придатності стрипів після розкриття пакету становлює 1 місяць при температурі 2-8˚ С. Невикористані стрипи зберігають у щільно закритому пакеті!